date:2023-01-13 11:17:11
體外細胞培養(yǎng)是研究細胞功能、了解疾病和發(fā)現(xiàn)新藥的重要工具。這些實驗中的大部分是在組織培養(yǎng)處理過的塑料器皿中進行2D單層細胞培養(yǎng)。然而，這與活細胞的體內(nèi)環(huán)境看起來完全不同。細胞嵌入由其他細胞和結(jié)構(gòu)組成的組織中，稱為細胞外基質(zhì)（ECM；圖1A）。細胞對細胞和細胞對ECM的相互作用以及這些組織內(nèi)的機械力對細胞形態(tài)和行為有著至關(guān)重要的影響。此外，活體組織中的營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、氧氣和CO2暴露于3D細胞結(jié)構(gòu)（例如腫瘤）與2D單層中有非常大的區(qū)別的（圖1B和1C）。
圖1A：活體組織中具有細胞間接觸和細胞間ECM接觸的細胞示意圖。
圖1B：3D腫瘤球體的示意圖，外部為增殖細胞，內(nèi)部為壞死細胞，中間為靜止細胞。外部的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)濃度很高，而內(nèi)部的二氧化碳和代謝廢物含量很高。
圖1C：使用ibidi泵系統(tǒng)灌注培養(yǎng)14天后，L929球體在µ-Slide Spheroid Perfusion, Bioinert中的活/死FDA/PI染色，0.75 ml/min。綠色：活細胞（熒光素二乙酸酯，F(xiàn)DA）；紅色：死細胞（碘化丙啶，PI）。寬場熒光顯微鏡，10倍物鏡。
研究人員在建立細胞培養(yǎng)模型以研究細胞功能、特定疾病(如癌癥)或表征某些藥物之前，必須考慮這些因素。為了獲得最接近體內(nèi)的實驗結(jié)果，盡可能地模擬活體組織的生理條件也是有意義的。
在本文中，我們引入了不同的三維細胞培養(yǎng)模型來研究細胞在體內(nèi)的狀態(tài)。
從單層細胞到組織：
雖然細胞仍然主要是在細胞培養(yǎng)處理過的塑料表面或包被蛋白質(zhì)或厚細胞基質(zhì)(2.5D培養(yǎng))的2D單層中培養(yǎng)，但當你想用更生理的方式培養(yǎng)細胞時，你可以選擇各種3D細胞培養(yǎng)模型(圖2)?？梢允褂没谥Ъ艿募夹g(shù)，如聚合物或水凝膠，它們通過合成化學聚合物或蛋白質(zhì)網(wǎng)絡提供結(jié)構(gòu)支持。或者，可以使用無支架技術(shù)獲得3D細胞結(jié)構(gòu)，其中復雜的細胞聚集體或整個組織可以在沒有額外結(jié)構(gòu)支持的情況下形成。
圖2: 2D和3D細胞培養(yǎng)模型概述
這兩種方法各有利弊，在決定哪種技術(shù)最適合各自的研究問題時，應考慮這些利弊。支架方法考慮了細胞與ECM的相互作用，而懸浮生長的球體可以更好地控制細胞的環(huán)境。
為了在顯微鏡上進行3D結(jié)構(gòu)的長期培養(yǎng)和研究，已經(jīng)開發(fā)了特殊的工具和技術(shù)，以確保在長時間內(nèi)持續(xù)提供介質(zhì)并模擬生理條件。
基于支架的3D細胞培養(yǎng)模型：
3D細胞培養(yǎng)模型的支架可以從多孔聚合物膜到模擬ECM細胞微環(huán)境的復雜水凝膠。
一般來說，水凝膠形成交聯(lián)聚合物的結(jié)構(gòu)，可以吸收和結(jié)合大量的水。在4°C或室溫下，混合物為液體，但在37°C時會形成凝膠。這一特性使得液體與細胞混合成為可能，然后在37°孵育時將細胞嵌入3D基質(zhì)中。這使得細胞能夠保留特定的體內(nèi)特征，例如細胞ECM相互作用或環(huán)境的生理和機械特性。
有不同類型的水凝膠，如Matrigel®或膠原蛋白，它們源自有機來源。也有復雜的合成水凝膠，其優(yōu)勢是能對其成分（分子、交聯(lián)劑等）進行精確的控制。這使其能對各個組成部分的影響得出不同的結(jié)論。
無支架3D細胞培養(yǎng)模型：
支架獨立方法允許在沒有基質(zhì)支持的情況下在3D中培養(yǎng)細胞。它們依賴于細胞自組裝成聚集體或球狀體的概率。為了促進這種自組裝過程，人們建立了各種各樣的技術(shù)。
圖 3：在µ-Slide 4 Well中培養(yǎng)的纖維蛋白水凝膠中出牙的人腸成纖維細胞和內(nèi)皮細胞球狀體。內(nèi)皮細胞用CD31染色(黃色)，成纖維細胞用波形蛋白染色(紅色)，DNA用DAPI染色(青色)。共焦圖像由H. Nogueira Pinto，生物工程3D微環(huán)境組，Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S), Universidade do Porto, Portugal。
懸滴技術(shù)
懸滴技術(shù)是生物學中行之有效的方法，已用于許多不同的應用，如觀察整個(微觀)生物體或蛋白質(zhì)的結(jié)晶。它利用重力形成懸浮液滴，懸掛在玻璃板上。在過去的十年中，這項技術(shù)已經(jīng)被改進并適用于3D細胞培養(yǎng)的應用，能夠從細胞懸浮液中形成球狀體，而無需支撐支架(圖4)。如今，專門的懸滴板已在市場上銷售。然而，雖然這種方法適用于球狀體的生成，但不可能將其與高分辨率顯微鏡相結(jié)合。
圖 4：懸滴法原理
超低吸附 (ULA) 涂層
所謂的低粘附板是涂有中性電荷或親水性蛋白質(zhì)或水凝膠，可減少細胞對板表面的附著，從而形成 3D細胞結(jié)構(gòu)。盡管這種涂層主要防止細胞附著，但在更長的時間后，細胞粘附仍可能發(fā)生，因為涂層通常只是物理吸附而非共價結(jié)合——因此不具有長期穩(wěn)定性。
生物惰性表面
與標準的ULA涂層相比，生物惰性表面是共價結(jié)合的，并提供穩(wěn)定的表面鈍化。因此，它可以完全防止蛋白質(zhì)或細胞附著在涂層表面。這促進了細胞間的相互作用和3D細胞聚集的形成，即使是在長期實驗中(圖5)。
圖5: ibidi聚合物蓋玻片生物惰性表面的球狀體形成
微圖案表面微孔板
在Bioinert表面上壓印微圖案可以使細胞精確粘附在指定位置（圖6）。
圖6：微圖案點上的細胞附著動態(tài)圖
µ-patterned圖案處周圍的鈍化區(qū)域有助于形成3D細胞聚集體和球狀體（圖7和8）。
圖7：微圖案點上球體形成的原理
圖8：接種在200 µm粘附點上的NIH-3T3細胞系懸浮液，64小時活細胞成像，相差，4x 物鏡。
具有特殊幾何形狀的微孔板、微流控器官芯片和用于長期3D細胞培養(yǎng)的設備
為了體外細胞培養(yǎng)盡可能接近體內(nèi)條件，與灌注設備相結(jié)合的微流控器官芯片檢測變得越來越重要。在這種應用中，細胞被嵌入到微通道中的基質(zhì)中。這些通道可以灌注培養(yǎng)基或藥物，用于在流動或藥物篩選下進行長期細胞培養(yǎng)（圖9和10）。
具有特殊幾何形狀的微孔板允許進行特定的基于3D細胞的測定（如：傷口愈合或趨化性測定）或模擬不同的器官（如：肺或肝）。
圖9：ibidi µ-Slide Spheroid Perfusion球體灌注的工作原理，它可連接到泵系統(tǒng)（如ibidi泵系統(tǒng)），用于長期培養(yǎng)球狀體
圖 10：L929 成纖維細胞在 µ-Slide Spheroid Perfusion, Bioinert球體灌注中顯示球狀體形成，，第1-14天，接種濃度5 x 105個單細胞/ml。左圖：無灌注，每隔一天更換一次培養(yǎng)基。右圖：使用 ibidi 泵系統(tǒng)灌注，0.75 毫升/分鐘。相差顯微鏡，10 倍物鏡，孔徑 800 µm。
總之，通過從2D細胞單層到3D細胞培養(yǎng)，已經(jīng)在模擬活體組織的生理條件方面取得了巨大的進展。這可以更好地讀取基于細胞的分析、疾病模型和藥物效應，從而使細胞培養(yǎng)總體上更準確，成為動物模型的更好替代品。
ibidi開發(fā)用于3D細胞模型分析的產(chǎn)品
有關(guān)球體、類器官和3D細胞培養(yǎng)的更多信息，請查看：ibidi 3D細胞(球狀體、類器官和單細胞)培養(yǎng)（←點擊即可查看）。
參考文獻：
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