活細胞成像：ASAP1直接影響細胞遷移機制
ASAP1調(diào)節(jié)以F-actin為基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)和功能，比如定點粘附性（focal adhesions, FAs）,質(zhì)膜折皺（circular dorsal ruffles，CDRs），細胞伸展和遷移。ASAP1需要N端的BAR基團發(fā)揮作用。美國的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)nonmuscle myosin 2A(NM2A)在體外實驗中與ASAP1的BAR-PH串聯(lián)體直接結(jié)合?？茖W(xué)家用co-IP的方法在細胞內(nèi)定位了ASAP1和NM2A發(fā)現(xiàn)，如果下調(diào)ASAP1將會減少細胞內(nèi)NM2A和F-actin，并且會對細胞遷移，FAs，細胞伸展和CDRs都造成影響。
本實驗中，將NIH3T3成纖維細胞種在腔室載玻片中，并在一天后，采用固定時間間隔連續(xù)拍照的方式在采集結(jié)果，并且分析細胞遷移的軌跡。一般NM2A激活后，會抑制細胞遷移能力。在用siRNA下調(diào)NM2A或ASAP1的細胞的遷移能力有顯著的提升。
J Biol Chem. 2016 Apr 1;291(14):7517-26. doi: 10.1074/jbc.M115.701292. Epub 2016 Feb 17
The Arf GTPase-activating Protein, ASAP1, Binds Nonmuscle Myosin 2A to Control Remodeling of the Actomyosin Network..
Chen PW, Jian X, Heissler SM, Le K, Luo R, Jenkins LM, Nagy A, Moss J, Sellers JR, Randazzo PA
一、實驗材料
1）細胞： NIH3T3
2）試劑： fibronectin（10 μg/ml, Calbiochem）
無酚紅DMEM培養(yǎng)基
雙抗
3）培養(yǎng)耗材：µ-Slide 8孔腔室載玻片，ibiTreat底部處理 （ibidi，Germany，80826）
二、實驗方法
一）載玻片包被
① 每孔加入300μl 的 10 μg/ml的fibronectin溶液
② 室溫孵育60分鐘
③ 吸除所有液體并小心用PBS沖洗5-10分鐘，即可開始使用
二）細胞遷移實驗
1）鋪細胞，每孔鋪約10000個細胞，過夜培養(yǎng)
2）置于倒置顯微鏡上，用20X倍鏡觀察
3）每8分鐘采集一張圖片，持續(xù)5.5-6.5個小時
4）使用ImageJ分析細胞遷移軌跡。
三、實驗結(jié)果
如圖所示，下調(diào)ASAP1或NM2A后，細胞遷移的距離和遷移的速度都有顯著的增長。
滬公網(wǎng)安備31011202005471 
